Il DNA estratto dai lieviti è stato amplificato attraverso una tecnica denominata PCR. 

I prodotti dell’amplificazione sono stati sottoposti a digestione (frammentazione) con Enzimi di Restrizione. Si tratta di proteine di origine batterica appartenenti alla classe delle endonucleasi, scoperte dal microbiologo svizzero Werner Arber insieme a Daniel Nathans e Hamilton Smith, i quali ricevettero il premio Nobel nel 1978. Questi enzimi agiscono come delle forbici capaci di tagliare la doppia elica del DNA di qualsiasi organismo in corrispondenza di siti specifici, detti siti di restrizione, ossia delle sequenze di DNA da 4-8 bp che costituiscono delle palindromi, cioè sequenze ripetute invertite che lette nelle due direzioni mostrano perfetta complementarietà. Esistono due tipi di enzimi di restrizione: 

➢ alcuni tagliano in modo sfasato la doppia elica generando delle estremità “coesive” (sticky ends) in cui uno dei due filamenti è sporgente rispetto all’altro ➢ altri operano tagli netti e ne risultano estremità piatte (blunt ends) 

Applicazioni degli enzimi di restrizione: 

○ Studio della funzione di un gene => il gene di interesse viene tagliato con enzimi di restrizione e inserito in un vettore di espressione digerito con gli stessi enzimi in modo da avere estremità compatibili. 

○ Determinazione di polimorfismi RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Nel genoma degli organismi esistono delle variazioni di singole basi del DNA fra individui diversi, dette polimorfismi. Tali modifiche possono interessare siti di restrizione e pertanto, in seguito a digestione con enzimi di restrizione, si osservano delle differenze nel profilo di frammentazione di tratti di DNA di individui diversi. 

Nel nostro caso l’utilizzo di tali enzimi e l’osservazione di profili RFLP differenti ha consentito l’identificazione di specie. 

L’ Elettroforesi su gel di agarosio è una tecnica che prevede la migrazione di molecole di DNA in un campo elettrico attraverso il gel di agarosio, sfruttando le cariche presenti nel DNA. Il gel di agarosio funge da setaccio, essendo costituito da una rete di pori, i quali permettono di separare le molecole in base alla loro grandezza: quelle più piccole attraverseranno facilmente i pori rispetto a quelle più grandi, consentendo una separazione in funzione della velocità di migrazione. I campioni da analizzare vengono depositati con micropipette in apposite fenditure verticali, dette pozzetti, praticate nel gel a poca distanza dal margine nella parte del polo negativo. Essendo il DNA dotato di cariche negative, applicando una differenza di potenziale, migrerà in avanti verso il polo positivo. Per visualizzare il DNA si possono utilizzare dei coloranti, ossia sostanze che si inseriscono tra le basi del DNA. Infine, si ottengono profili di migrazione da cui ricavare la dimensione dei singoli frammenti di DNA facendo il confronto con un riferimento di peso molecolare noto, in modo da poter stabilire se le bande osservate corrispondono a DNA appartenenti a specie uguali o diverse. A tal fine il laboratorio dispone di un software in grado di catturare un’immagine del profilo elettroforetico, facilitando l’interpretazione dei dati.